傷口愈合／細胞劃痕實(shí)驗新方法－如何劃出筆直均一的劃痕

前言
     傷口愈合實(shí)驗是體外研究細胞遷移的一個(gè)有用的實(shí)驗。原理是人為的在鋪板的單層細胞中制造一個(gè)空白的無(wú)細胞的地帶，然后對這個(gè)無(wú)細胞地帶的邊緣的細胞進(jìn)行觀(guān)察；這些邊緣的細胞會(huì )開(kāi)始進(jìn)行遷移活動(dòng)，并且zui終覆蓋整個(gè)無(wú)細胞的區域，重新互相接觸在一起。
 
 
傳統實(shí)驗方法
     細胞在培養皿內貼壁后，使用移液槍的槍頭在貼壁細胞的中間劃過(guò)，人為造成一道傷口（劃痕），之后定時(shí)測量劃痕的寬度，進(jìn)而得到傷口愈合的細胞遷移數據。
 
實(shí)驗缺點(diǎn)：
1.手動(dòng)劃痕，不能保證每次劃痕的一致；
2.有時(shí)候在劃細胞的同時(shí)會(huì )刮壞一片細胞，對劃痕的邊緣的細胞造成機械損傷；
3.如果培養皿底部還有包被蛋白的話(huà)，槍頭劃過(guò)，很可能傷害到包被，進(jìn)而影響到細胞遷移，結果便很難判斷是哪個(gè)因素造成了決定性的影響。
4.定時(shí)測量劃痕的寬度，計算劃痕寬度隨時(shí)間推移的變化；在選取劃痕測量點(diǎn)時(shí)，不可避免地引入了主觀(guān)誤差（人為選取了遷移結果符合實(shí)驗預期的點(diǎn)）；
 
       綜上，傳統的傷口愈合方法總是重復性不佳，對于實(shí)驗結果的闡述說(shuō)服力不足。
       下面分享一種新方法，輕松得到筆直均一的劃痕！
 
實(shí)驗核心
       使用傷口愈合插件制造筆直均一的劃痕（圖一）。

實(shí)驗方法     
一.實(shí)驗材料
1) 細胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
2) 實(shí)驗耗材:   ibidi 35 mm培養皿帶傷口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
3) 細胞培養基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
4) 細胞消化試劑:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
5) 滅菌鑷子
6) 倒置顯微鏡，如果需要進(jìn)行連續的觀(guān)測搭配鏡載加熱孵育系統
 
一.實(shí)驗步驟
1.鋪細胞（圖二）
為了獲得更好的實(shí)驗結果，在做實(shí)驗之前進(jìn)行一次預實(shí)驗，以確定需要使用的細胞懸液的密度。我們建議，將細胞懸液密度調整為24小時(shí)后正好可以長(cháng)滿(mǎn)每個(gè)插件的小孔。
● 將ibidi傷口愈合培養皿底部的保護膠帶撕除。
● 準備細胞懸液，調整懸液濃度為3*105 cells/ml，這樣24小時(shí)后，細胞能剛剛長(cháng)滿(mǎn)單個(gè)小孔。
● 在ibidi細胞插件的每孔中加入70μl的細胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養皿。以防止細胞不均勻。
● 在37。C培養箱中孵育24小時(shí)。

圖二：A. 去除培養皿底部的保護膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細胞。
 
1.形成“劃痕”
當所有細胞都貼壁并且剛剛長(cháng)滿(mǎn)的時(shí)候，就可以開(kāi)始傷口愈合實(shí)驗了。用鑷子將傷口愈合插件提出，之后加入新鮮的培養基，或者在培養基中加入刺激劑，然后觀(guān)察傷口愈合的情況。
● 24小時(shí)后對細胞前一天種的細胞做鏡檢。細胞要貼壁并且是剛剛長(cháng)滿(mǎn)每個(gè)孔。長(cháng)得過(guò)多移除插件時(shí)會(huì )帶走很多細胞，長(cháng)得過(guò)少，傷口愈合的效果很差。
● 如圖三所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。 

圖三：用鑷子移除插件
● 移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”（圖四）。
● 小心的清洗細胞，之后加入2ml培養基進(jìn)行培養。

圖四 筆直均一的劃痕
 
1.采集并分析圖像
一般傷口愈合實(shí)驗都是采集一張“劃痕”的初始圖像，再在實(shí)驗結束時(shí)候采集一張“劃痕”愈合的圖像。我們建議可以在這個(gè)過(guò)程多做幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，這樣可以觀(guān)測到細胞遷移隨時(shí)間的變化特征。
● 在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向在視野內為水平的或者垂直的。
● MCF-7細胞每半小時(shí)采集一張圖片，一直持續到20小時(shí)。
● 采用ibidi傷口愈合分析軟件，統計細胞的覆蓋面積，做出曲線(xiàn)圖，可以看到在大約11個(gè)小時(shí)的時(shí)候，細胞基本就已經(jīng)長(cháng)滿(mǎn)了，接下來(lái)幾個(gè)小時(shí)細胞覆蓋面積都不會(huì )發(fā)生變化（圖五）。

圖五(a)  顯微鏡下觀(guān)察細胞覆蓋面積的變化

圖五(b)  細胞覆蓋面積的數據統計
 
 
實(shí)驗總結對比
1.本實(shí)驗方法能得到重復性更好的劃痕（圖六）；

圖六 通過(guò)計算劃痕的面積可以看出，在多次實(shí)驗中，槍頭劃痕（左圖）
制造的劃痕面積數據波動(dòng)大，重復性差；ibidi傷口愈合插件（右圖）制造的劃痕面積數據統一，重復性良好
 
 
2.不會(huì )刮壞細胞，也不會(huì )造成劃痕的邊緣的細胞有機械損傷；
 
3.不會(huì )傷害到培養皿底部的包被蛋白；

圖一：左圖表示槍頭劃過(guò)后，底部包被蛋白被劃傷，細胞遷移結果受到底部不均一的影響。右圖ibidi插件移除后底部的包被蛋白沒(méi)有被破壞。
 
4.通過(guò)計算細胞覆蓋面積得出細胞遷移結果，避免人為選取測量點(diǎn)，使數據更客觀(guān)。1天內就能得到測量結果，實(shí)驗分析更快更準確。