高通量組織研磨儀對真菌細胞的破壁及DNA提取

實(shí)驗目的
       對真菌細胞進(jìn)行破壁，提取其DNA。
 
實(shí)驗原理
       隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，PCR相關(guān)方法越來(lái)越多地被應用到真菌學(xué)研究中來(lái)，而真菌DNA的提取是包括分子診斷在內的所有實(shí)驗的基礎，簡(jiǎn)便快捷地提取真菌DNA，且獲得的DNA完整、純度高，對真菌分子生物學(xué)的研究有及其重要的意義。
       真菌細胞壁以幾丁質(zhì)、葡萄糖為主構成細胞壁骨架，而基質(zhì)則由多糖、甘露聚糖、糖蛋白、脂質(zhì)等填充。絲狀真菌堅韌厚壁的構成，需要較為繁瑣的破壁手段，故真菌DNA的提取較細菌或其他組織細胞難度更大。為保證真菌PCR技術(shù)及其相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的順利開(kāi)展，簡(jiǎn)便快捷地提取真菌DNA，且獲得的DNA完整、純度高，是必須解決的前提條件。
 
實(shí)驗材料和器具
樣品：真菌類(lèi)
儀器：高通量組織研磨儀（上海凈信，Tissuelyser-48）
耗材：離心管（上海凈信，0.4研磨單位），研磨珠（上海凈信，6號，1顆）
試劑：TE Buffer，DA Buffer，E Binding Buffer，Elution Buffer
 
實(shí)驗步驟
方法1
1.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中，加0.08mlTE Buffer，加入石英砂100mg；
1.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中，設置頻率13單位振頻，研磨10min；
1.3 取出離心管于65°C環(huán)境中溫浴30min，然后移出；
1.4 加入0.65mlDA Buffer，混合均勻后于冰浴中放置5min；
1.5 放入離心機14000r/min離心3min；
1.6 將上清液轉移到一個(gè)新的0.5研磨單位離心管中，加0.15ml的E Binding Buffer，并混合均勻，將混合液體轉移至Spin column；
1.7 放入離心機6000r/min離心1min，棄去接液管中液體；
1.8 Spin column中加入0.12ml的Wash Buffer，于10000r/min離心30s，棄去接液管中液體；
1.9 重復步驟1.8，棄去接液管中液體后，再10000r/min離心60s，Spin column轉到新的EP管中；
1.10 Spin column中加入0.03ml Elution Buffer，室溫放置1min。12000 r/min離心60s，并棄去Spin column。
 
方法2
2.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中，加0.08ml10×TE Buffer，加入石英砂100mg；
2.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中，設置頻率60hz，研磨2-3min；
2.3 加入0.024ml10%SDS，加入0.002ml蛋白酶K，混勻，65°C環(huán)境中水浴30min；
2.4 然后渦旋1min，加入0.024ml5M NaCl，加入1/10體積的10%CTAB（約0.013ml）；2.5 于65°C水浴60min，渦旋1min；
2.6 抽提，加入1/2體積（約0.07mi）的Tris飽和酚及1/2體積（約0.07ml）的lvfang：異戊醇（24:1），混勻；
2.7 于離心機14000轉離心1min，取上清液到另一離心管中；
2.8 重復步驟2.7 2-3次（視兩相界面雜質(zhì)多少而定）。
2.9 加入等體積lvfang：異戊醇（24:1）混勻，14000轉離心10min，取上清液至另一離心管中；
2.10 zui后開(kāi)始沉淀，加入0.045ml NH4Ac，輕柔混勻，冰水中放置30min，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，14000轉離心10min，棄上清液；
2.11 用1000ul70%乙醇清洗沉淀，室溫晾干，加0.04ml TE Buffer溶解沉淀。